统计分析

实验数据用x±s表示，采用Prism8.0软件进行统计。两组间比较采用Studentt或Manny-Whitney检验，多组间比较采用单因素方差分析和Dunnettt或Tukey检验，不同时间点检测僵住时间百分率数据采用重复测量的单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结果

3种品系小鼠条件性恐惧获得的差异性

3种品系模型组小鼠随声音/场景-电击配对次数增加均呈现僵住时间百分率增加（图1），其中ICR小鼠末次检测的僵住时间百分率为（29±22）%，DBA小鼠为（35±19）%，C57小鼠为（81±20）%。3种品系正常组小鼠不同时间点僵住时间百分率无明显波动。

3种品系小鼠条件性恐惧表达的差异性

条件性恐惧训练24h后，分别进行场景恐惧检测和声音线索恐惧检测，评价不同品系小鼠条件性恐惧表达的差异。ICR，DBA和C57模型组小鼠场景恐惧的僵住时间百分率分别为（8±11）%，（26±20）%和（45±16）%（图2），其中DBA小鼠和C57小鼠模型组与对照组相比有统计学差异（P<0.05，P<0.01）。如图3所示，ICR，DBA和C57模型组小鼠在新环境下的僵住时间百分率分别为（2±3）%，（5±5）%和（14±9）%，提示不同品系小鼠在新环境下未呈现恐惧反应。在30s的声音刺激期，上述3种品系模型组小鼠的僵住时间百分率分别为（13±24）%，（47±26）%和（66±19）%，其中DBA小鼠和C57小鼠模型组与对照组相比有统计学差异（P<0.05，P<0.01）。

C57小鼠条件性恐惧自然消退

分别于条件性恐惧训练第2天（D2）、D7、D14、D21和D28进行5min场景恐惧和30s声音线索恐惧检测，评价C57小鼠条件性恐惧自然消退的行为特点。如图4A所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28场景恐惧的僵住时间百分率分别为（45±16）%，（25±12）%，（19±8）%，（16±7）%和（25±14）%，其中D2与对照组相比有统计学差异（P<0.01）。如图4B所示，C57小鼠D2，D7，D14，D21和D28声音线索恐惧的僵住时间百分率分别为（65±21）%，（69±13）%，（52±23）%，（58±31）%和（48±22）%，其中D2，D7，D14，D21与对照组相比有统计学差异（分别为P<0.01，P<0.01，P<0.01）。

C57小鼠声音线索恐惧的消退训练和保持

条件性恐惧训练24h后，采用30s声音刺激30s间歇期的方法进行10轮声音消退训练，如图5A所示，随消退训练次数增加，C57小鼠声音线索恐惧反应逐渐降低，第1轮和第10轮声音刺激期僵住时间百分率分别为（55±30）%和（32±27）%。消退训练24h后进行消退保持测试，如图5B所示，C57小鼠在30s声音刺激期的僵住时间百分率为（47±35）%

讨论

根据与创伤记忆是否具有直接联结，PTSD模型可分为敏化模型和条件性恐惧模型，其中敏化模型包括单程长时应激模型、时间依赖敏化模型、单程短暂电击模型、天敌模型和社会挫败模型等。无论是PTSD患者还是敏化动物模型都会出现恐惧反应增敏和（或）消退障碍等症状，因此条件性恐惧模型在PTSD病理机制研究和抗PTSD药物评价中具有重要价值。条件性恐惧模型是基于巴甫洛夫条件反射，以电击刺激为创伤性应激因子，将中性条件性刺激（如应激环境、声音或灯光）和厌恶性的非条件刺激（电击）进行多次配对，动物可获得场景关联恐惧（以环境为线索的恐惧条件化）和（或）声音线索恐惧（以声音为线索的恐惧条件化）。

条件性恐惧分析系统，XR-XC404，上海欣软

条件性恐惧模型的建立与多种因素密切相关，如动物品系、电击强度、电击时间、声音刺激时间、声音-电击配对次数、配对方式、预适应方式、间歇期时间和实验目的等。训练过程是恐惧条件化的学习过程，不同实验室采用的造模训练方式不同。由于药物对恐惧行为既可能发挥促进作用也可能发挥抑制作用，因此本研究希望通过训练方案的优化将僵住时间百分率控制在40%~60%。此外，本研究拟在D2同时检测场景和声音线索恐惧的表达，因此恐惧条件化训练时增加了间歇期时间，如仅检测声音线索恐惧的表达，则可缩短适应期和间歇期的时间。在文献调研和预实验的基础上，本研究发现声音-电击配对5次可成功诱导C57小鼠形成场景恐惧和声音线索恐惧，DBA小鼠可诱导形成声音线索恐惧但无法形成场景恐惧，而神经精神药理学研究最常用的远交系小鼠品系ICR小鼠则无法诱导形成场景恐惧和声音线索恐惧，提示动物品系可能对条件性恐惧模型能否成功具有决定性的影响。结合恐惧消退和保持的实验结果，本研究发现C57小鼠为条件性恐惧研究的敏感品系鼠，易形成恐惧反应，声音线索恐惧可持续3~4周。

条件性恐惧分析系统，XR-XC404，上海欣软

除训练方式外，不同实验室采用的检测指标和检测方式也不尽相同。僵住行为的检测指标分为僵住时间和僵住次数2种，二者记录方式不同［13-14］。僵住时间是记录检测周期内动物呈现僵住反应的累计时间，而僵住次数则是间隔固定时间（常为6~10s，与检测周期长短有关）判断一次动物是否处于僵住状态，进而记录累计僵住次数。本研究以小鼠为研究对象，条件性恐惧模型僵住行为研究时采用了计算机软件自动记录僵住时间的方法。

但值得注意的是，如以大鼠为研究对象，部分大鼠呼吸幅度较深，可能会影响计算机软件采集数据的准确性，此时建议采用人工记录僵住次数的方式进行数据采集。此外，本研究还对声音线索恐惧的检测方式进行了优化。目前，文献报道的检测场景恐惧采用的时长多为3~11min，其中以记录5min内的僵住时间最常见，本研究也采用该时长进行场景恐惧的检测。然而对于声音线索恐惧，多数文献中采用检测2或3min内僵住时间或次数的方法，而本研究发现，2min长时声音刺激时，小鼠发生了时间依赖的恐惧消退，此种方式检测的声音线索恐惧的僵住时间百分率不足30%（结果未列出），因此通过预实验，本研究将声音线索恐惧的检测时间优化为30s。

此外，值得注意的是，条件性恐惧模型是否成功不应仅以统计学结果作为参照，而应结合研究目的，以僵住时间百分率是否满足实验需求为核心依据。例如，本研究中D2进行的场景恐惧表达检测中，DBA模型小鼠的僵住时间百分率虽与正常组相比显著增加，但DBA模型组僵住时间百分率仅为25%，因此DBA小鼠并非场景恐惧检测的合适品系，模型组25%的僵住率也无法满足检测药物作用的目的。

综上，本研究确定了C57小鼠为敏感品系，建立了恐惧获得、表达、自然消退、消退训练和消退保持各阶段恐惧行为检测的实验方法，成功建立了小鼠条件性恐惧模型，该模型稳定可靠，具有良好的可重复性。